1.血糖浓度的测定 一、静脉血浆糖(VPG)和血清糖测定 原来用还原糖试剂(如邻甲苯胺)测定,现改进为用“真”糖试剂测定,如己糖激酶、葡萄糖 6 磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶等;从手工操作改进为半自动或自动测定。因为邻甲苯胺对醛糖(如葡萄糖、半乳糖、木糖甚至抗坏血酸)均可有反应,并在酸性环境中产生绿色,因而可用比色法测定。但邻甲苯胺对葡萄糖并无特异性,而且酸性溶液对自动化测定的管道有破坏,故近年已逐步被淘汰。
葡萄糖氧化酶法目前应用最广泛, 因本法基本上不受其他化合物的干扰。此酶氧化葡萄糖后产生过氧化氢, 可用另一检测系 统测定过氧化氢的多少, 而得出血糖含量。近年应用己糖激酶法,此酶将葡萄糖转化为葡萄糖 6 磷酸(G6P),当有另外的 G6P 脱氢酶(G6PD)存在时,可以测定此酶还原 NADP 的能力而测出葡萄糖。
目前多以己糖激酶法作为血糖测定的参考标准。但测静脉血糖由于抽血麻烦,用血多,且当时看不到结果,因此应用受到一定限制。又因 血清糖比肝素化的血浆糖浓度高 5%,这可能因红细胞中液体因抗凝剂而转到血浆中之故。
所以一般不测血清糖, 而仅测血浆糖。
二、毛细血管全血糖(CBG)测定 20 世纪 70 年代发明的袖珍血糖仪,可用一滴毛细血管全血测定血糖,患者可自测血糖(SMBG),快速得出结果,决定治疗变动,缩短住院日,这是糖尿病治疗史上的一个里程碑。靠此才有可能于 20 世纪 80 年代开始糖尿病并发症与控制试验(DCCT)研究,并于 1993 年明确了严格控制血糖的治疗目标。
CBG 测定原理一般为葡萄糖氧化酶比色反应。此酶作为触酶使葡萄糖氧化为葡萄糖酸及过氧化氢,而过氧化氢使氧接受剂氧化而产生颜色改变,可用反射光度计或吸收光度计测定。以后也用电化学测定反应过程中产生的电流,而得出血糖值。有些仪器改用己糖激酶或葡萄糖脱氢酶进行类似反应。SMBG 由于可由患者自行操作等优点,故美国糖尿病协会(ADA)等不但推荐 CBG 为患者自用,且定为住院患者床边检查之用,尤其在急诊室、手术室、特护病房(ICU、CCU)等更为适用。至 2003 年的文件上仍强调要推广 SMBG。而 VPG 测定主要作为诊断、校正袖珍血糖仪、科研及作其他生化检查时附带测定。CBG 与 与 VPG 不同,因 因 CBG 用血量少, 产生误差的机会更多,我们对此应有了解。
方法（1）葡萄糖氧化酶法：特异性强、价廉、方法简单。其正常值：空腹全血为 3.6～5.3 毫摩尔/升（65～95 毫克/分升），血浆为 3.9～6.1 毫摩尔/升（70～110 毫克/分升）。
（2）邻甲苯胺法：结果较可靠，由于血中绝大部分非糖物质及抗凝剂中的氧化物同时被沉淀下来，因而不易出现假性过高或过低。其正常值：空腹全血为 3.3～5.6 毫摩尔/升（60～100 毫克/分升），血浆为 3.9～6.4 毫摩尔/升（70～115 毫克/分升）。
（3）福林吴氏法：此法测得之血糖含量，并非全部为葡萄糖，有不少是非糖的还原物质。因而测得的数值比实际高，本法已趋向淘汰。空腹血糖正常值为 4.4～6.7 毫摩尔/升（80～120 毫克/分升）。
（一）样本：血浆或血清。
血糖测定一般可以测血浆、血清和全血葡萄糖。由于葡萄糖溶于自由水，而红细胞中所含的自由水较少，所以 全血葡萄糖浓度比血浆或血清低 10% ～15%，且受红细胞比容影响。一般来说 用血浆或血清测定结果更为可靠。除与标本的性质有关外，血糖测定还受饮食、取血部位和测定方法影响。餐后血糖升高，静脉血糖<毛细血管血糖<动脉血糖。所以如果不是特殊试验，血糖测定必须为清晨空腹静脉取血。
降 取血后如全血在室温下放置，血糖浓度每小时可下降 5% ～7%约（约 10mg ／dl）左右；定 如立即分离血浆或血清，则可稳定 24h.如不能立即检测而又不能立 即分离血浆或血清，就必须将血液加入含 氟化钠 的抗凝瓶，以抑制 糖酵解途经中的酶，保证测定准确。
（二）方法 1.氧化还原法：（Folin-Wu 法）葡萄糖可使二价铜离子还原为一价铜离子，然后一价铜离子又可和某些化合物显色进行测定。葡萄糖与碱性铜试剂共热与磷钼酸成蓝色钼兰。
该法易受血中其他还原糖的干扰，现已淘汰。
2.缩合法：邻甲苯胺法（0-TB 法）利用邻甲苯胺类在酸性环境中可与葡萄糖醛基缩合成葡萄糖基胺，后者脱水生成 Schiff氏碱，再经结构重排，生成有色物质。
该法操作简便，灵敏度高，主要缺点是试剂腐蚀性大，邻甲苯胺被怀疑有致癌性，既有碍于健康又易损坏仪器。
以上非酶法均为非特异性方法，由于非糖还原物质，如谷胱甘肽，维生素 C、肌酸、肌酐、尿酸等也都能参与反应，可使结果比酶法偏高 0.3～0.6mmol／L.3.酶法：包括葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）偶联法、己糖激酶（HK）法和葡萄糖氧化酶-氧速率（GOD-OR）法。
酶法采用特定的酶促生化反应步骤，因此具有特异性高。
（1）葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法（GOD-POD 法）：目前应用最广泛的常规方法。
505nm 比色，其色泽深浅与葡萄糖浓度成正比。
评价：准确度、精密度、灵敏度和稳定性良好是目前血糖测定的首选方法。
GOD 催化的反应特异，只有葡萄糖反应，POD 不特异受干扰因素较多，如血中有还原性物质，如尿酸、维生素 C、胆红素和谷胱甘肽等可使 H202 还原为 H2O，可致结果偏低。
（2）葡萄糖氧化酶-氧速率法（GOD-OR 法）：葡萄糖氧化酶每氧化标本中的一分子葡萄糖便消耗一分子氧，用氧敏感电极测定氧消耗速率，便可知葡萄糖含量。此法准确性和精密度都很好，但只能用于特殊的分析仪。
（3）已糖激酶法（HK 法）：是目前公认的参考方法。
NADPH 在 340nm 有吸收峰，其吸光度增加与葡萄糖浓度成正比。
该反应第一步不特异，任何己糖均可参与，第二步特异，只有 G-6-P 才能反应。
评价：本法准确度和精密度高，特异性高于葡萄糖氧化酶法。干扰因素少，轻度溶血、脂血、黄疸、肝素、EDTA 等不干扰测定。
试剂较贵。
己糖激酶法 己糖激酶是六碳糖的磷酸化酶，催化使葡萄糖从稳定状态变为活跃状态，活化一个葡萄糖需要消耗 1 个 ATP，一个 ATP 放出一个高能磷酸键，大约放出 30.5kj 自由能，大部分变为热量而散失，小部分使磷酸与葡萄糖结合生成葡萄糖-6-磷酸。
在己糖激酶催化下，葡萄糖和 ATP 发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)与 ADP。前者在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)催化下脱氢，生成 6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时使 NADP 还原成 NADPH。反应式如下：
根据反应方程式，NADPH 的生成速率与葡萄糖浓度呈正比，在波长 340nm 监测吸光度升高速率，计算血清中葡萄糖浓度。
概述 在己糖激酶催化下，葡萄糖和三磷腺苷(adenosine triplcosphate，ATP)发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)与二磷酸腺苷(adenosine driplcosphate，ADP)。前者在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)催化下脱氢，生成 6-磷酸葡萄糖酸(6-GP)，同时使氧化型辅酶Ⅰ(NADP)还原 成 还 原 型 辅 酶 Ⅰ(NADPH)反 应 式 如 下 ：
葡 萄 糖 +ATP → G-6-P+ADP;G-6-P+NADP →6-GP+NADPH+H。
根据反应方程式，NADPH 的生成速率与葡萄糖浓度呈正比，NADPH 在 340 nm 有特异吸收峰，在波长 340 nm 处监测吸光度升高速率，计算血清中葡萄糖浓度。
过程 酶馄合试剂的成分与浓度 根据试剂盒说明书复溶后，混合配制成酶试剂，置棕色瓶中放冰箱保存，约可稳定 7 天。
2．5mmol/L 葡萄糖标准应用液 手工操作 1．速率法测定(以半自动分析仪为例)(1)主要参数(2)加样；37℃预温酶混合试剂 1000μ1，加血清 20μ1，立即吸入自动分析仪，监测吸光度升高速率(△A/min)。
(3)计算 2．终点法测定：取 16mmXl00mm 试管，按下表编号与操作。
以上各管充分混匀，在 37℃水浴，准确放置 10min，分光光度计波长 340nm、比色杯光径 10mm，用蒸馏水调零，分别读取各管吸光度(Au、Ac、As、AB)。
计 算 参考值 空腹血清葡萄糖为 3.89—6.1lmmol/L(70 一 110mg/dl)。
附 注 1．己糖激酶方法的特异性比葡萄糖氧化酶法高，是目前公认为测定血糖的参考方法，适用于自动分析仪。轻度溶血、脂血、黄疽、维生素 C、氟化钠、肝京、EDTA 和草酸盐等不干扰本法测定．因为从红细胞释放出的有机磷酸酯和一些酶能消耗 NADP，故干扰本法测定。
虽然根据 NADPH 的摩尔吸光度可以直接计算血清葡萄糖浓度(如 Boehringer、Roche 等试剂盒)，但建议最好同时测定标准管和空白管(蒸馏水代替血清)。此时计算公式应为：
葡萄糖氧化酶对 β-D 葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约 36% 为 α 型，64% 为 β 型。葡萄糖的完全氧化需要 α 型到 β 型的变旋反应。葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。新配制的葡萄糖标准液主要是 α 型，故须放置 2h 以上(最好过夜)，待变旋平衡后方可应用。
本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素 C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。但是对测定结果无显著影响。
